Victor Deroncele

μ- NOTA 25

By Víctor Deroncelé

La prueba del Citrato forma parte de una batería de pruebas bioquímicas conocidas como IMViC, Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno.

 La prueba del citrato determina si una  bacteria tiene la  capacidad de utilizar citrato como su fuente de carbono y energía. Si es positiva, es porque se han generado subproductos alcalinos del metabolismo del citrato. El aumento pH del medio se demuestra por el cambio de color del indicador de pH. La prueba del citrato suele formar parte de una batería de pruebas utilizadas para identificar patógenos gramnegativos. Por ejemplo, kits como API-20E (bioMerieux) y Enterotube II (BD Diagnostics), incluyen la utilización de citrato como una de las pruebas de diagnóstico.

En el medio de Simmons el citrato es la única fuente de carbono, mientras que la sal de amonio inorgánica (NH4H2PO4) es la única fuente de nitrógeno. Cuando un ácido orgánico como el citrato es utilizado como fuente de carbono y energía, se producen carbonatos alcalinos. La observación de crecimiento y el cambio en el color del indicador de pH debido al aumento del pH apuntan a que la bacteria puede importar citrato y utilizarlo como única fuente de carbono y energía. A estos organismos se les considera citrato positivos.

El citrato, un intermedio del ciclo de Krebs (es decir, del ciclo del TCA o el ciclo del ácido cítrico), es generado por muchas bacterias; sin embargo, la utilización de citrato exógeno requiere la presencia de proteínas transportadoras de citrato (permeasas).

Una vez absorbido por la célula, el citrato es escindido por la citrato liasa para formar oxaloacetato y acetato. Luego el oxaloacetato se metaboliza a piruvato y CO2.

En condiciones alcalinas, el piruvato se metaboliza a acetato y formiato. A pHs por debajo de  7  también se producen lactato y acetoína. El dióxido de carbono que se libera reacciona con el agua y el ion sodio en el medio para producir carbonato de sodio, un compuesto alcalino que elevará el pH. Además,  se produce hidróxido de amonio cuando se utilizan las sales de amonio del medio, como única fuente de nitrógeno. El resultado, el indicador de pH (azul de bromotimol)  que es verde a pH neutro, con un aumento del pH por encima de 7,6, cambia a color  azul.

Para realizar la prueba del citrato se inocula el medio citrato de Simmons el pico de la flauta del agar, usando asa de siembra recta o aguja, e incubarse durante 24 horas a 35-37 °C. Culminado el tiempo se observan los resultados. El sembrado se realiza únicamente en la superficie del agar, sin hacer punción.

  • Cuando se está sembrando una batería de pruebas bioquímicas para la identificación del microorganismo en cuestión, es importante que la prueba del citrato sea la primera en inocularse, para evitar el arrastre de proteínas o carbohidratos de otro medio.
  • Se puede evitar el arrastre de sustancias quemando bien el asa y tomar nuevo inoculo entre una prueba y otra.
  • También se debe tener cuidado al tocar la colonia para realizar el inoculo, pues debe evitarse arrastrar parte del agar del cultivo del cual provienen las bacterias.

Resultado positivo: Crecimiento y cambio de color de verde a azul intenso desde el pico de flauta.

Resultado negativo: Sin crecimiento o sin cambio de color, pico de flauta verde.

Controles de la prueba:

  • Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883— (Crecimiento, color azul)
  • Negativo: Escherichia coli ATCC 25922—Sin crecimiento o crecimiento muy débil

 

Preguntas frecuentes:

P: ¿Para qué se utiliza la prueba del Citrato?

R: Se utiliza para diferenciar bacterias en base a la utilización del citrato como fuente de carbono y energía.

P: ¿Cuál es indicador de pH?

R: Bromotimol azul.

P: ¿Utiliza E. coli el citrato?

R: E. coli no puede usar el citrato, aeróbicamente, porque no tiene el transportador de citrato, pero puede usar el citrato en condiciones anaeróbicas a través de la expresión de sistema antiporte citrato/succinato.

P: ¿Qué bacterias son citrato-positivas?

R: Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Providencia, Proteus, Serratia, Vibrio cholerae, Pseudomonas, Salmonella enteritidis y los subgéneros II, III y IV de Salmonella.

Referencias y lecturas adicionales: