Prueba de la oxidasa

El termino oxidasa es una forma resumida de hacer referencia a la enzima citocromo oxidasa, también conocida como indofenol oxidasa. En la antigüedad se creyó que las enzimas citocromo oxidasa y la indofenol oxidasa eran dos enzimas diferentes, pero hoy se sabe que son la misma.

Se pueden utilizar varios reactivos para esta prueba.

• Reactivo Oxidasa de Kovacs: Dihidrocloruro de tetra-metil-p-fenilendiamina (CAS Nº.: 637-01-4) al 1%, en agua.

Oxidasa positiva: la colonia cambia a color púrpura casi negro (entre 5 a 15 seg).

Oxidasa negativa: no hay cambio de color de la colonia o esta toma una ligera coloración rosada.

• Reactivo de Gordon y McLeod: Dihidrocloruro de dimetil-p-fenilendiamina(CAS Nº.: 536-46-9) al 1%, en agua.

Este reactivo es ligeramente más estable que el reactivo de oxidasa de Kovacs, aunque todos los reactivos que contienen p-fenilendiamina son inestables.

Esta reacción es más tardía, se interpreta como positiva con la aparición de un color azul –púrpura dentro de aproximadamente 10 minutos.

• Reactivo Gaby y Hadley (indofenol oxidasa:
  • α-naftol al 1% en etanol al 95%
  • clorhidrato de p-aminodimetilanilina al 1%

• Reactivo de Carpenter, Suhrland y Morrison: Está compuesto por oxalato de p-aminodimetilalanina (CAS No.: 62778-12-5) al 1%. Se prepara de igual manera que el reactivo de oxidasa de Kovacs. Con esta solución se pueden  preparar tiras reactivas, impregnando tiras de papel de filtro Whatman N°1 de 6-8 cm, con el reactivo de oxalato de dimetil-p-fenilendiamina al 1%.Estas tiras se dejab secar y se pueden conservar en nevera. Son estables hasta por 6 meses.

La mayoría de las bacterias oxidasa positivas también son catalasa positivas, condición necesaria para eliminar el H2O2 que se produce cuando los microorganismos oxidasa positivos utilizan el oxígeno para generar energía a través de la respiración aeróbica.

La prueba de oxidasa se usa para determinar si un organismo posee la enzima citocromo oxidasa. Es útil para la diferenciación de especies de Neisseria, Moraxella, Campylobacter y Pasteurella (oxidasa positiva). También se utiliza para diferenciar Pseudomonadales de especies relacionadas.

Procedimiento

Existen varios protocolos para llevar a cabo la prueba de la oxidasa, pero las más populares son: el de papel de filtro, directo en la placa, el del hisopo, el que usa tiras reactivas impregnadas y en tubos de ensayo.

• Método de la placa directa: adicionan 2 o 3 gotas de cualquiera de los reactivos antes mencionados, directamente sobre la colonia, crecida en un medio de cultivo que no contenga glucosa. Se observa el cambio o no de color de las colonias, no del medio.
• Método indirecto sobre papel: Se coloca un trozo de papel de filtro (de unos 6 cm²) dentro de una placa de Petri vacía. Luego se adicionan 2 o 3 gotas del reactivo de oxidasa de Kovacs en el papel, y se toma parte de la colonia que se quiere estudiar con un asa de platino o palillo de madera y extenderla en línea recta sobre el papel impregnado de reactivo. Interpretar en un lapso de 5 a 10 segundos.
• Método indirecto sobre papel preparadas con el reactivo Carpenter, Suhrland y Morrison: se extiende una colonia sobre la tira seca. Una misma tira sirve para probar varias cepas. Interpretar en 10 seg.

Controles de la prueba de la oxidasa

• Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
• Negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Referencias:

1. Shields P, Cathcart L. Oxidase test protocol. American Society for Microbiology. 2010:1-9.